Carbapenemases novas ou emergentes em Pseudomonas aeruginosa / New or emerging carbapenemases in Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa é um importante agente de infecções relacionadas à assistência à saúde em todo o mundo. O tratamento empírico de infecções graves causadas por esta espécie usualmente inclui os carbapenêmicos. Essa terapia, se inadequada, está relacionada a um aumento significativo da mortalidade. Os principais mecanismos de resistência aos carbapenêmicos em bacilos Gram-negativos são a redução da permeabilidade da membrana externa, hiperexpressão de bombas de efluxo e produção de betalactamases, sendo este último, o mais eficiente. O objetivo deste trabalho consistiu na caracterização de carbapenemases novas ou emergentes e seu contexto genético em P. aeruginosa. Foram utilizados 11 isolados de P. aeruginosa capazes de hidrolisar o imipenem em ensaio espectrofotométrico e negativos para genes de carbapenemases conhecidos e uma cepa produtora de KPC-2. Tais isolados foram submetidos à confirmação do perfil de resistência aos carbapenêmicos pelos métodos de disco-difusão e microdiluição em caldo (CIM), bloqueio enzimático com EDTA e Blue-Carba. O perfil plasmidial foi avaliado utilizando-se os métodos de lise alcalina e eletroforese em campos pulsados (PFGE). Os genomas foram sequenciados utilizando-se o sistema MiSeq. O perfil clonal dos isolados foi avaliado por PFGE e Multilocus Sequence Typing (MLST). Dez isolados apresentaram Blue-Carba negativo, compatível com a presença de carbapenemases fracas. Quatro isolados apresentaram plasmídeos, visualizados em gel de agarose após PFGE. Os plasmídeos do isolado D5303023 foram eletroporados em E. coli TOP 10 e selecionados em meio LB contendo 1µg/mL imipenem, contudo não foram obtidos transformantes. A análise por PFGE identificou sete grupos clonais distintos. Quanto à tipagem por MLST, foi detectado um novo tipo ST3187 e os ST277 e ST1560 foram os predominantes. O isolado D9203039 apresentou uma carbapenemase GES-20 associada a uma betalactamase de espectro estendido GES-19, sendo os genes que as codificam localizados no integron In724. Esse isolado pertence ao ST309, clone de potencial alto risco, associado ao fenótipo de resistência a múltiplos antimicrobianos no México. O genoma da cepa positiva para KPC-2 foi digerido com a S1 nuclease e submetido à PFGE, evidenciando um plasmídeo de aproximadamente 453 kb. Após análise do sequenciamento confirmou-se que a cepa pertence ao ST446 e foi observada a presença do gene blaKPC-2 em um contig de 128.487 bp. Este contig apresentou 99,9% de similaridade com o plasmídeo 1 da cepa P. aeruginosa RW109; no entanto, ensaios de conjugação bacteriana falharam em obter colônias de transconjugantes. O gene blaKPC-2 foi encontrado flanqueado à montante por uma estrutura truncada de um transpóson da família Tn3 e à jusante por uma ISKpn6 truncada. As análises das sequências de DNA das demais cepas evidenciaram a presença de sequências gênicas, que traduzidas, apresentavam similaridade para sete metalobetalactamases (MBL), indicando a potencial presença de novos genes de carbapenemases. Foi caracterizada pela primeira vez no Brasil cepa produtora da carbapenemase GES-20 e o novo ST3187. Foram detectados potenciais novos genes de carbapenemases. O gene blaKPC-2 no isolado J5083553 tem provável localização plasmidial

Pseudomonas aeruginosa is a major agent of healthcare-related infections worldwide. Empirical treatment of serious infections caused by this species usually includes carbapenems. This therapy, if inadequate, is related to a significant increase in mortality. The main mechanisms of carbapenem resistance in Gram-negative bacteria are the reduction of outer membrane permeability, overexpression of efflux pumps and beta-lactamase production, the latter being the most efficient. The aim of this work was the characterization of new or emerging carbapenemases and their genetic context in P. aeruginosa. Eleven P. aeruginosa isolates capable of hydrolyzing imipenem in spectrophotometric assay and negative for known carbapenemases genes were used, as well as a KPC-2 producing strain. These isolates were subjected to confirmation of carbapenem resistance profile by disk diffusion, broth microdilution (MIC) and enzyme inhibition by EDTA and Blue-Carba methods. Plasmid profile was evaluated using alkaline lysis and pulsed field electrophoresis (PFGE) methods. Genomes were sequenced using the MiSeq system. The clonal profile of the isolates was evaluated by PFGE and Multilocus Sequence Typing (MLST). Ten isolates presented negative Blue-Carba, compatible with the presence of weak carbapenemases. Four isolates presented plasmids visualized on agarose gel after PFGE. The plasmids of isolate D5303023 were electroporated into E. coli TOP 10 and selected in LB medium containing 1 µg/mL imipenem, however no transformants were obtained. The PFGE analysis identified 7 distinct clonal groups. As for MLST typing, a new type ST3187 was detected and the ST277 and ST1560 were the predominant types. The genome of the KPC-2 positive strain was digested with S1 nuclease and subjected to PFGE, evidencing a plasmid of approximately 453 kb. Isolate D9203039 presented a GES-20 carbapenemase associated with a GES-19 extended spectrum beta-lactamase. The genes encoding them were located in the In724 integron. This isolate belonged to ST309, a potential high risk clone, associated with the multidrug resistant strain in Mexico. After sequencing it was confirmed that the strain belongs to ST446 and it was observed the presence of the blaKPC-2 gene in a contig of 128,487 bp. This contig was 99.9% similar to plasmid 1 of the P. aeruginosa RW103 strain. However, bacterial conjugation assays failed to obtain transconjugant colonies. The blaKPC-2 gene was found flanked upstream by a truncated structure of a Tn3 family transposon and downstream by a truncated ISKpn6. DNA sequence analysis of the other strains showed the presence of gene sequences, which translated, showed similarity to seven metallo-beta-lactamases (MBL), indicating the potential presence of new carbapenemase genes. It was characterized for the first time in Brazil carbapenemase producing strain GES-20 and the new ST3187. Potential new carbapenemase genes were detected. The blaKPC-2 gene in isolate J5083553 has plasmid localization

Análisis de expresión génica durante la respuesta de defensa de la yuca a la bacteriosis vascular (Añublo Bacteriano) / Gene expression analysis during cassava defense response to bacterial blight disease

La bacteriosis vascular de la yuca es una destructiva enfermedad en Sur América y África, causada por la bacteria Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam). Produce pérdidas entre el 12 por cien y 100 por cien de los cultivos. Algunos estudios se han realizado a nivel bioquímico y citoquímico para conocer las respuestas de defensa de la yuca a Xam; sin embargo,las bases moleculares de los mecanismos de defensa no han sido aún caracterizadas. Con el propósito de identificar genes diferencialmente expresados durante la respuesta de la planta al patógeno, se ha construido una librería sustractiva, usando el método de Sustracción Diferencial en Cadena (DSC), con 1536 clones de dos variedades resistentes(MBRA 685 y SG 107-35). De esta librería fueron seleccionados al azar 110 clones para ser secuenciados y realizar búsquedas de similitud en bases de datos públicas. El análisis de secuencia mostró 14 clones con similitud a genes previamente reportados como involucrados en procesos de defensa en plantas, 70 clones con similitud a genes de plantas sin función conocida o que no presentaron similitud, representando nuevos genes potencialmente involucrados en las respuestas de defensa de la yuca. Finalmente fueron construidos microarreglos de ADNc, usando los clones seleccionados de las librerías sustractivas para confirmar su expresión diferencial durante el desarrollo dela infección.

Frequência dos polimorfismos dos genes do TNF alfa e da MTHFR em um grupo de pacientes leucêmicos da cidade do Salvador-Ba / Frequency of gene polymorphisms of TNF alpha and MTHFR in a group of leukemia patients in Salvador-Ba

As leucemias são neoplasias hematológicas decorrentes do desequilíbrio entre as taxas de proliferação, maturação e apoptose das células hematopoéticas, comumente associadas com polimorfismos gênicos. Polimorfismos nos genes do TNFa e da enzima MTHFR têm sido associados como fatores de susceptibilidade para diversas patologias, inclusive neoplasias hematológicas. O presente estudo investigou a freqüência do polimorfismo -308 da região promotora no gene do TNFa, cuja variante genotipica AA está associada a níveis de transcrição elevados da citocina, e dos polimorfismos C677T e A1298C no gene da MTHFR, que estão associados com atividade enzimática reduzida. Para investigação dos polimorfismos foi utilizada a técnica de PCR-RFLP. Foram estudados 94 pacientes leucêmicos, sendo 66 portadores de LMC e 28 de LMA-M3, além de 100 indivíduos da população de Salvador. Dos 66 pacientes com LMC, cinco (7,6%) foram homozigotos para a variante genotipica menos comum (AA) do polimorfismo -308 do TNF. Essa freqüência foi de 3,7% entre os 28 portadores de LMA-M3 e de 3,0% entre os indivíduos do grupo populacional. Dentre os portadores de 66 LMC, dois (3,0%) foram homozigotos para a variante TT do polimorfismo C677T da MTHFR, sendo que foi encontrada frequência de 7,1% entre os portadores de LMA- M3 e de 6,0% para o grupo populacional. Para o polimorfismo A1298C da MTHFR, as freqüências encontradas para a variante CC foram de 4,5% entre os 66 portadores de LMC, 3,6% entre os 28 portadores de LMA-M3 e 5,0% entre os indivíduos do grupo populacional. Diante dos resultados obtidos, concluímos que os polimorfismos -308 (TNFa), bem como C677T e A1298 (MTHFR) parecem não interferir diretamente com os mecanismos de patogênese da LMC e LMA-M3.

Evaluation of different techniques for the differentiation of pathogenic and non pathogenic strains of Yersinia enterocolitica

Diferentes métodos e testes para avaliar o potencial patogênico de Y. enterocolitica de sorotipos diversos têm sido utilizados. Testamos 60 cepas do microrganismo, sendo 25 de origem humana (sorotipo 03 biotipo 4 e sorotipo 05 biotipo 1): 6 de origem animal (sorotipo 03 biotipo 4 ); 19 isoladas do meio ambiente (sorotipo 05.27 biotipos 1 e 2 ) isoladas de alimentos (sorotipo 05 biotipo 1 e sorotipo 05.27 biotipo 1 ). Foram utilizados testes relacionadosà expressäo de genes plasmidiais (autoaglutinaçäo, dependência ao cálcio a 37ºC e absorçäo do corante Vermelho Congo), de genes cromossomais (presença de enzima pirazinamidase, fermentaçäo da salicina e hidrólise da esculina) além do teste de invasäo em células HEp-2. Todas as Y enterocolitica 03 exceto uma, foram potencialmente patogênico frente aos testes pirazinamidase-salicina-escalina, o mesmo näo ocorrendo com os testes relacionados a genes plasmidiais, quando os resultados näo foram täo uniformes, provavelmente pela perda do plasmídeo; o teste de invasibilidade em células HEp-2 apresentou os resultados monos uniformes. As cepas de Y. enterocolitica 05 também tiveram comportamento uniforme, sendo näo potogênicas frente aos dois grupos de testes (plasmidiais e cromossomais); em relaçäo ao teste de invasäo em células HEp-2 näo houve uniformidade. As cepas do sorotipo 05.27 biotipo 1, mostraram-se uniformes em relaçäo aos testes cromossomais, sendo näo patogênicas; näo apresentaram no entanto, resultados conclusivos nos testes relacionados à genes plasmidiais e invasäo em células HEp-2. Conclui-se que os testes relacionados a genes cromossomais (esculinasalicina-pirazinamidase) säo simples e muito eficazes na detecçäo de Y. enterocolitica potencialmente patogênicas, originárias de caos clínicos